人類口腔菌群研究中雙生子模型的進展

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［摘要］人體內有大量的微生物存在，且與人體的多種機能、代謝以及身體健康狀況、疾病等密切相關。不論是口腔疾病，還是全身的一些系統性疾病，其發生發展都與口腔菌群的定植、代謝、生長、繁殖有關，因此對于口腔菌群的探索是研究口腔疾病及某些全身系統性疾病的關鍵環節。雙生子模型在遺傳方面具有特殊性，其組內個體的遺傳背景高度一致，接觸環境也極其相似，可使研究的納入對象之間高度配對，從而能夠控制組內變量，排除混雜因素，提高研究的可信度，在人類菌群研究中有明顯的優勢。目前，已有眾多學者通過雙生子模型證實了環境、遺傳等因素對人類口腔菌群有一定的影響，從而為口腔及全身疾病的預防、治療提供了新的思路。本文就雙生子模型用于人類口腔菌群研究的進展情況作一綜述。

［關鍵詞］雙生子模型;口腔菌群;口腔疾病

人體攜帶著大量微生物，最新的研究估計，人體所攜帶的微生物數量與人體體細胞數目的比值約為1∶1［1］;并經大量研究發現，這些微生物與人體健康和疾病均有著密切的聯系。口腔微生物不僅影響著口腔健康，導致齲病、牙周病等菌斑性疾病的發生［2－3］，同時還與心血管疾病、糖尿病、腫瘤等系統性疾病的發生發展密切相關［4］。以齲病為例:齲病是一種常見的慢性、感染性疾病，可引起牙體缺損、牙髓炎癥、疼痛［5］，不僅會影響患者的生活質量，同時還會增加社會的經濟負擔。目前對齲損的主要治療方式是去齲后的充填治療。前期已有體外和口內模型研究證實，抗菌藥物改性的充填材料能調節體外生物膜的生態結構、功能［6－9］，從而達到抗菌目的。雖然這些研究盡可能的模擬口內環境，但由于個體差異，以及體外生物膜菌種的單一等原因，依舊難以實現完全模擬。因此對于齲病乃至口腔菌群的研究仍亟待有更好的研究模型，而雙生子模型則能一定程度的解決以上問題。雙生子分為同卵雙生子和異卵雙生子，其中同卵雙生子理論上擁有完全相同的遺傳基因，而異卵雙生子的基因約為50%相同;無論是同卵雙生子還是異卵雙生子，由于其早期在母體內接觸到的環境基本相同，因此兩者個體差異較小。基于雙生子的這一特點，近幾十年來，已有國內外學者應用雙生子模型對人類口腔的菌群進行了分析研究，以期找到可能與疾病相關的微生物及其與宿主的關系，但仍存在不足之處，如動物模型的缺乏，前瞻性的研究較少等。本文就雙生子研究模型用于人類口腔菌群研究的進展情況作一綜述。

1雙生子模型的定義、優點及運用

雙生子研究是利用同卵雙生子和異卵雙生子的基因共享程度及表型相似性，來確定復雜疾病或性狀的遺傳學基礎，并判斷遺傳因素和環境因素對表型變異的相對貢獻大小［10］。相較于其他研究模型而言，雙生子模型在人類研究中的優勢在于:配對兩個體的基因相似、在母體內和出生后所接觸的環境也類似，且生活習慣接近，從而能很好的控制變量;在年齡、性別等方面能更好的匹配，有利于排除干擾、混雜因素，以便更高效能的研究疾病的發生發展與機體內某些因素或指標之間的關系［11］。除此之外，由于同卵雙生子的相關性較高，因此運用患病狀況不同的雙生子進行病例對照研究時所需樣本量相對較少［12］。經典的雙生子模型主要用于研究特定的表型或特征與遺傳和環境之間的聯系，如果某種特征在同卵雙生子組內表現相同，而在異卵雙生子中有差異，則說明該特征受到遺傳因素的影響較大;反之，如果某些特定的表現型在同卵和異卵雙生子中都不同，則考慮環境因素造成這種差異的可能性較大。同卵雙生子遺傳背景相同，且后天環境相似，但卻出現不同的表型時，這樣的雙子模型則可以作為病例對照研究的對象，有助于對人類菌群與疾病關系的研究，Ridaura等通過在無菌鼠腸道接種胖瘦狀況不同的同卵雙生子的腸道菌群后發現，接種較胖個體微生物的小鼠體重增長大于接種較瘦個體微生物的小鼠［13］。該研究為人類肥胖癥的治療提供了更加有效且持久性的方式，即通過相關益生菌或益生元的植入并搭配飲食的改變可治療人類肥胖癥。

2雙生子卵性鑒定

由于同卵雙生子和異卵雙生子在基因相似程度方面并不同，因此鑒別雙生子的類別尤為重要，否則會影響其遺傳傾向性的判斷，尤其是在樣本量較小的實驗研究中。現有多種分辨雙生子類別的方法，其中相對簡單的方法是通過問卷的形式，若雙生子個體身體形態、面部長相等特征相同的多，且兩人常被其他人認錯時，則判定為同卵雙生子，反之為異卵雙生子。雖然這種方法帶有一定的主觀性，但由于簡單易行，已成為一種常用的方法，尤其是在樣本量較大時，其可行性較高。且有學者研究發現，通過問卷和詢問的方式來鑒別雙生子卵性時，其準確度可以達到90%［14］。隨著分子技術的發展，DNA標記物成為了判斷同卵或異卵雙生子更為準確、可靠的方法［15］。鑒定方法的逐漸成熟，為雙生子的準確卵性確定和雙生子模型的構建奠定了基礎。

3雙生子模型在人類口腔菌群研究中的應用

在口腔菌群的研究中，雙生子模型的使用較為廣泛，涉及了唾液微生物、齲病微生物、口腔菌群定植時間等方面，旨在探究齲病、牙周病等相關微生物的特征與遺傳和環境因素之間的關系。Goodman在20世紀50年代首次使用雙生子模型進行口腔領域的研究。該研究共納入38對性別相同的雙生子(其中19對同卵19對異卵)，并利用體外培養計數的方式檢測了雙生子唾液中變異鏈球菌和乳酸桿菌的檢出情況，結果顯示異卵雙生子的組內差異總是大于同卵雙生子的組內差異，提示基因對人類唾液微生物可能存在決定性的作用;作者分析認為，這種差異可能是由于同卵雙生子的父母會以更為相似的方式對待孩子，從而導致同卵雙生子所接觸到的環境更加相似，至于雙生子唾液微生物的組成和量與齲損之間存在怎樣的聯系，還需后續的研究進一步證實［16］。此后，相繼有越來越多的研究者通過雙生子模型研究遺傳或后天環境因素對于口腔菌群各方面特征的影響。部分研究發現，環境因素對于口腔微生物的影響可能超過遺傳因素的影響。例如:杜芹等［17］使用聚合酶鏈反應－變性梯度凝膠電泳(PCR－DGGE)探究了20對雙生子的口腔微生物群組的組成和結構，結果發現同卵雙生子和異卵雙生子組內均表現出明顯的聚類分布，說明雙生子間口腔微生物的組成相似度比較高;但同卵雙生子和異卵雙生子之間的相似度無統計學差異，根據經典雙生子模型的研究結果判斷，口腔微生物的組成受環境因素影響的可能性更大。Papapostolou等［3］也得到了相似的結果，作者對雙生子齦上和齦下菌斑進行了限制性內切酶片段長度多態性分析(RFLPanalysis)后發現，在納入的95對雙生子中，同卵雙生子組和異卵雙生子組在齦上、齦下菌斑組成的相似性上無統計學差異。Ooi等［18］研究發現，同卵雙生子中兩個個體均能檢出變異鏈球菌的概率與異卵雙生子相似，兩者無統計學差異，而且乳酸桿菌的檢出率也有相似的情況。齲病的發生受多種因素的影響，其中牙菌斑是重要的始動因素之一，而變異鏈球菌和乳酸桿菌則是現代科學家們普遍認同的主要致齲菌。從以上的研究結果來看，人類口腔菌群的組成受到環境因素的影響較大，而遺傳方面的影響相對較小。Bretz等［19］側重于口腔菌群的產酸情況進行了相關研究，結果顯示，其研究對象中的各對雙生子的菌群產酸量的分布無顯著差異，在同卵和異卵雙生子間也是如此，從而得到了環境因素對口腔菌群產酸情況的影響大于遺傳因素影響的結論。以上研究結果提示，治療和預防齲病過程中可考慮將環境因素作為靶點，即通過調節環境而中斷或防止齲病的發生。但由于環境因素所指代的范圍過于廣泛，以上研究也并未指出某些能發揮具體作用的部分。因此，仍需大量的后續研究，一方面進一步證實這些結果的準確性;另一方面則希望能對環境和口腔菌群之間的關系有更深入的研究，以期找到更加具體和明確的研究靶點，從而發現齲病防治的新方法。除了經典的雙生子模型外，由于雙生子在一些個體基本特征上的高度匹配性(如性別、年齡、種族及基因型等)，也常有研究者將其運用到齲病及口腔菌群的研究中。Bockmann等［20］以151對同卵雙生子嬰幼兒(受試者均為0～1歲)為對象，結果顯示:有93%的雙生子其口腔變異鏈球菌的定植時間相同(平均在12個月左右)，從而為人群中嬰幼兒口腔中變異鏈球菌定植時間的確定提供了參考。變鏈球菌是重要的致齲菌之一，深入研究其在口腔中的定植等情況，對于預防或延遲兒童感染變異鏈球菌，更好的判斷個體的患齲風險而言意義重大。通常而言，要找到整個人群的口腔變異鏈球菌的定植時間，所需流行病學調查的樣本量巨大，且操作困難，而納入雙生子為研究對象，則可以減少樣本量，降低操作難度，所得到的數據也具有一定的參考價值。Corby等［11］通過雙生子模型評價了口腔生物膜中細菌定植能力的可遺傳性。該研究共納入102對雙生子(其中包括齲活躍性高的個體以及未患齲的個體，并要求一對雙生子內兩個個體的患齲情況相同)，通過對雙生子牙菌斑中微生物DNA的棋盤雜交、微生物豐富度計算、可遺傳性分析后發現，約有20種微生物在齲活躍度高的組和未患齲的組之間有顯著性差異;與無齲組相比，齲活躍組牙菌斑中豐富度高的細菌多為與齲病相關的細菌，如變異鏈球菌和乳桿菌屬;而在無齲組牙菌斑中檢出較多的細菌則是一些已知的或可能有益于口腔健康的細菌，且多具有中等或較高的可遺傳性。由于齲病的發病率較高，其防治依舊是公共衛生的一大難題。通過分析患齲與非患齲個體口腔菌群的差異，或許能夠找到與齲病發生高度相關的細菌，然后再針對這些細菌及其特征找到預防、治療齲病的新方法，以期達到降低個體的患齲風險、減輕社會醫療負擔的目的。目前對于人類菌群方面的研究，已經逐步發現了遺傳及環境因素等與菌群的相關性，包括口腔微生物、腸道微生物等領域。其中腸道菌群的研究較為深入和成熟，而在口腔菌群方面，目前已有的眾多研究大多僅局限于描述性的，究竟口腔菌群的相關特征受環境因素或遺傳因素的影響何者更大，以及口腔菌群是如何受到影響的，都尚未有較為肯定的答案，還需后續更加深入的研究來揭示口腔疾病的有關機理，雙生子模型也將發揮更大的作用。

4展望

隨著微生物研究從單一物種轉向群落的研究，研究中能夠得到的信息量越來越大，如何合理選擇和利用數據，是研究者們需要思考的問題之一，這其中，模型的使用顯得尤為重要。一個好的模型不僅能提高數據的可信度，降低研究操作難度，同時還能夠為后期的類似實驗提供參考。雙生子模型基于其獨特的遺傳環境特性，在微生物群落研究中有著先天的優勢。然而，目前對于雙生子模型在群落方面的應用研究還不夠深入。比如，在口腔菌群的研究方面，利用雙生子模型研究主要還是描述性的研究為主，且多關注于比較同卵雙生子和異卵雙生子間有無差異，從而推斷遺傳因素或者環境因素的影響。但是，在大量的臨床診治和調查中，我們同樣會發現同卵雙生子的口腔健康狀況完全不同的病例出現，對于這類患者目前仍僅有描述性研究。要解釋在遺傳背景相同，環境因素幾乎一致的配對個體組內為何會出現這種差異，則需要進行更加具有前瞻性的研究，來揭示口腔健康的奧秘。人源化的動物模型是目前研究腸道菌群與相關疾病之間關系的常用手段之一，通過與雙生子模型的結合，可將宿主菌群轉移至動物體內，并復制宿主的表型，從而探究菌群與疾病之間的關系。但是，關于口腔菌群的研究，目前尚未見相應的人源化動物模型的報道。在今后的研究中，對于口腔菌群的研究可以利用患病情況不同的同卵雙生子的唾液和菌斑進行人源化動物模型的建立，然后再結合臨床資料以及基因水平的分析，以期能更有效的找到導致同卵雙生子口腔健康狀態不同的可能原因。雙生子模型在人類菌群研究中的優勢顯著，并能控制變量，減小個體間的差異;而人源化的動物模型則能在一定程度上模擬人體內的狀態，通過兩者的結合，有望能為人類口腔菌群的研究打開新的思路和方向。

作者：吳虹樂 任彪 程磊 單位：口腔疾病研究國家重點實驗室 四川大學華西口腔醫學院