生物工程技術(shù)在生物凈化上的應(yīng)用

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【摘要】目的：探究在大小鼠生物凈化中應(yīng)用生物工程技術(shù)的效果。方法：自2016年1月開(kāi)始，本研究中心選擇常用的C57BL/6J品系小鼠作為研究A組、選擇SD大鼠作為研究B組，在繁殖中應(yīng)用生物工程技術(shù)；另選擇一部分小鼠與大鼠作為對(duì)照A、B組，在其繁殖過(guò)程中不做任何干涉隨機(jī)。每組研究對(duì)象15只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)所有鼠的病原微生物進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用體外受精與胚胎移植的生物工程技術(shù)，在HTF培養(yǎng)液中完成受精并發(fā)育至2-細(xì)胞時(shí)期，將胚胎移植入購(gòu)買來(lái)并激素處理過(guò)的代孕SPF級(jí)ICR雌鼠的輸卵管中。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周離乳后，對(duì)代孕ICR雌鼠和隨機(jī)挑選的子代一只進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)研究A、B組的采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)。統(tǒng)計(jì)四組研究對(duì)象的平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率。統(tǒng)計(jì)凈化前后四組研究對(duì)象的病原微生物檢出率及凈化率。結(jié)果：研究A、B組生物工程技術(shù)指標(biāo)（采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；四組研究對(duì)象平均每胎產(chǎn)仔數(shù)與存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；四組研究對(duì)象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機(jī)選一只與其代孕ICR母鼠一起進(jìn)行尾靜脈取血，進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)，對(duì)照A、B組的凈化率均顯著低于研究A、B組（P<0.05）。結(jié)論：在小鼠大鼠的生物凈化中應(yīng)用體外受精與胚胎移植的生物工程技術(shù)，在不影響代孕母鼠的生殖能力與子代存活率的情況下，顯著地提升了凈化率，達(dá)到了研究的目的，從而能為臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供更多優(yōu)質(zhì)可用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

【關(guān)鍵詞】體外受精；胚胎移植；C57BL/6J小鼠；SD大鼠；病原微生物

1材料與方法

1.1材料

自2016年1月開(kāi)始，本研究中心選擇常用的C57BL/6J品系小鼠作為研究A組、選擇SD大鼠作為研究B組，在繁殖中應(yīng)用生物工程技術(shù)；另選擇一部分小鼠與大鼠作為對(duì)照A、B組，在其繁殖過(guò)程中不做任何干涉隨機(jī)。每組研究對(duì)象15只。納入標(biāo)準(zhǔn)；所選小鼠與大鼠均為8周大；取血樣進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果出現(xiàn)了下面五種病原菌的任意一種：金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：接種了同種或異種動(dòng)物的腫瘤組織。

1.2方法

1.2.1體外受精

1.2.1.1應(yīng)用頸椎脫臼法處死雄性C57BL/6J小鼠與SD大鼠，剖開(kāi)腹腔，將兩側(cè)的睪丸與附睪取出，置于含HTF培養(yǎng)液的EP管中，在超凈工作臺(tái)中分離出附睪，將組織與血塊剔除后，將附睪放置于預(yù)先經(jīng)過(guò)平衡處理的HTF獲能液中處理2h，以完成獲能[5]。1.2.1.2體外受精前3d，對(duì)雌性C57BL/6J小鼠與SD大鼠進(jìn)行注射PMSG的處理（7.5IU）。在48h后，繼續(xù)對(duì)供卵的雌性注射7.5IU的hCG。14h后，經(jīng)過(guò)兩種激素處理過(guò)的雌鼠，頸椎脫臼處死，剖開(kāi)腹腔后將雙側(cè)輸卵管分離出來(lái)，置于預(yù)先經(jīng)過(guò)平衡處理的HTF培養(yǎng)液[6]，分離出卵團(tuán)。1.2.1.3選擇活力旺盛的精子，將其轉(zhuǎn)移進(jìn)入培養(yǎng)卵的培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，完成受精后洗滌受精卵。次日，選擇發(fā)育到2-細(xì)胞階段的胚胎進(jìn)行移植。

1.2.2胚胎移植[7]

1.2.2.1在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩周，對(duì)成熟的SPF級(jí)ICR雄鼠進(jìn)行結(jié)扎。將雄鼠用3%水合氯醛麻醉后，從睪丸處剪開(kāi)皮膚，找到輸精管，取一段約3mm長(zhǎng)的組織，以保證輸精管完全斷開(kāi)。待結(jié)扎雄鼠恢復(fù)一周后，進(jìn)行試懷孕，以確定將殘存在輸精管中的精子排除干凈，方可進(jìn)行接下來(lái)的假孕操作。1.2.2.2將成熟的SPF級(jí)ICR雌鼠與結(jié)扎雄鼠以2︰1的比例進(jìn)行合籠，次日上午8：00~9：00檢栓，見(jiàn)栓的雌鼠可以用來(lái)做胚胎移植的代孕母鼠[8]。1.2.2.3代孕母鼠用水合氯醛麻醉后，用酒精消毒后置于解剖鏡下，小鼠采取俯臥位，在肋骨下緣出剔除毛發(fā)，剪開(kāi)一個(gè)約5mm的切口，找到脂肪墊后將卵巢與子宮一并牽引出體外[9]。固定后，在解剖鏡下確定輸卵管傘部的位置。用自制的移卵吸管吸取滿足移植要求的2-細(xì)胞胚胎，從輸卵管傘部的切口出將胚胎吹入。關(guān)腹。將代孕的ICR雌鼠放置在SPF級(jí)鼠房[10]，等待其生產(chǎn)。

1.2.3新生仔鼠21d離乳后，與其代孕母鼠，一同進(jìn)行尾靜脈取血，涂抹在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，與細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，以確定是否發(fā)生病原微生物的感染[11]。

1.3觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)研究A、B組的采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)。統(tǒng)計(jì)四組研究對(duì)象的平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周離乳后，對(duì)代孕ICR雌鼠和隨機(jī)挑選的子代一只進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)凈化前后四組研究對(duì)象的病原微生物檢出率及凈化率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x-±s）表示，多組間比較采用方差分析，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用X2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1研究A、B組的采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)的對(duì)比研究A、B組生物工程技術(shù)指標(biāo)（采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.

2.2四組研究對(duì)象平均每胎產(chǎn)仔數(shù)、存活率對(duì)比對(duì)四組研究對(duì)象的平均每胎產(chǎn)仔數(shù)與存活率進(jìn)行分析，四組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3凈化前后四組研究對(duì)象的病原微生物檢出率及凈化率四組研究對(duì)象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機(jī)選一只與其代孕ICR母鼠一起進(jìn)行尾靜脈取血，進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)即性成熟后，對(duì)照組的凈化率顯著低于研究組（P<0.05）。

3討論

20世紀(jì)50~60年代，體外受精（invitrofertilization，IVF）與胚胎移植（embryotransfer，ET）開(kāi)始起步[12]，經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展與進(jìn)步，在小鼠與大鼠中運(yùn)用這兩種技術(shù)已經(jīng)非常成熟并得以廣泛應(yīng)用，在基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建、生物凈化、克隆動(dòng)物的建立中具有相當(dāng)重要的作用[13]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，最常用的就是SPF級(jí)動(dòng)物，這種動(dòng)物不僅能排除病原微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果的影響，還可以減少對(duì)一起飼養(yǎng)的同類與實(shí)驗(yàn)人員健康的不利影響[14]。SPF級(jí)動(dòng)物憑借其對(duì)飼養(yǎng)條件要求不高的特點(diǎn)受到了諸多研究人員的青睞，其中C57BL/6J小鼠與SD大鼠是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。通常在他處動(dòng)物中心購(gòu)買的小鼠大鼠，原實(shí)驗(yàn)室能夠保證動(dòng)物處于SPF級(jí)。由于多種原因，如從動(dòng)物中心購(gòu)買后的運(yùn)輸過(guò)程、實(shí)驗(yàn)室本身的安全級(jí)別較低，有可能會(huì)使應(yīng)該是無(wú)特定病原體級(jí)的小鼠與大鼠感染微生物，無(wú)法達(dá)到無(wú)特定病原體級(jí)的實(shí)驗(yàn)要求。在過(guò)去的時(shí)候，對(duì)小鼠大鼠進(jìn)行生物凈化，常用的是藥物處理，但這種方式的凈化率較為低下且成本高[15]。隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究表明，胎盤的屏障作用能夠防止病原微生物從母體側(cè)進(jìn)入胎兒的體內(nèi)。研究人員利用此原理，大力發(fā)展體外受精與胚胎移植技術(shù)在生物凈化中的應(yīng)用[14]。為此，本院選擇部分病原微生物檢測(cè)不合格的C57BL/6J小鼠與SD大鼠，體外受精后將胚胎移植進(jìn)入代孕的SPF級(jí)ICR雌鼠內(nèi)，以探究生物工程技術(shù)在生物凈化中的應(yīng)用。本研究中，將被微生物污染的雄性C57BL/6J小鼠與SD大鼠在實(shí)驗(yàn)室外處死后，取出儲(chǔ)存成熟精子的附睪，在超凈工作臺(tái)中分離出精子，在HTF培養(yǎng)液中使精子獲能[16]。對(duì)雄性進(jìn)行操作的同時(shí)，對(duì)同樣被污染的雌性C57BL/6J小鼠與SD大鼠，注射PMSG與hCG進(jìn)行超數(shù)排卵的操作，選擇形態(tài)與功能良好的卵團(tuán)與運(yùn)動(dòng)活躍的精子一同培養(yǎng)完成體外受精的操作。本研究中，應(yīng)用確定為SPF級(jí)ICR結(jié)扎雄鼠，與可孕的ICR雌鼠合籠誘導(dǎo)假孕，為接納體外發(fā)育至2-細(xì)胞時(shí)期的胚胎做好準(zhǔn)備[17]。　　目前，應(yīng)用胚胎移植技術(shù)進(jìn)行生物凈化有兩種策略，第一種是雌鼠與雄鼠自然合籠交配，從雌鼠的子宮角中分離受精卵，然后移植到代孕雌鼠體內(nèi)。這種操作需要研究人員從一側(cè)子宮角注射生理鹽水將胚胎沖出，所獲得的胚胎數(shù)目較少，而且需要大量的雌鼠與雄鼠合籠，成本比較高[18]。為了提高凈化率的同時(shí)盡可能地降低成本，研究人員開(kāi)發(fā)出了生物凈化的第二種方法——超數(shù)排卵、體外受精與胚胎移植。這種操作方法只需要處死一只雄鼠，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的用量，使得凈化的速度得以加快，種群得以快速繁殖[19]。　　本研究結(jié)果顯示，研究A、B組的生物工程技術(shù)指標(biāo)（采集卵子數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)與移植胚胎數(shù)）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；四組研究對(duì)象平均每胎產(chǎn)仔數(shù)與存活率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這兩個(gè)數(shù)據(jù)說(shuō)明了生物工程技術(shù)對(duì)代孕母鼠的生育能力未產(chǎn)生影響，對(duì)子代的生存率與質(zhì)量未產(chǎn)生影響；四組研究對(duì)象在合籠與體外受精前，均尾靜脈取血進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)。仔鼠出生3周離乳后，每胎隨機(jī)選一只與其代孕ICR母鼠一起進(jìn)行尾靜脈取血，進(jìn)行血霉菌培養(yǎng)，對(duì)照A、B組的凈化率均顯著低于研究A、B組（P<0.05）。　　綜上所述，在大小鼠的生物凈化中應(yīng)用體外受精與胚胎移植的生物工程技術(shù)，在不影響代孕母鼠的生殖能力與子代存活率的情況下，顯著地提升了凈化率，達(dá)到了研究的目的，從而能為臨床動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供更多優(yōu)質(zhì)可用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在實(shí)際的研究工作中有較大的應(yīng)用價(jià)值。

作者：劉勇 史嘉翊 劉潔婷 柏合 單位：牡丹江醫(yī)學(xué)院