淺說對生長因子與口腔黏膜的研究

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1實驗

無菌條件下取行智齒拔除術或牙齒助萌術患者健康牙齦組織，PBS(pH=7.4)徹底沖洗后，加入Dispase溶液2.0-3.0mL，4℃條件下消化過夜；次日，終止消化后，用眼科鑷將組織的表皮層與真皮層分離，將真皮層組織剪碎后，加入0.1%Ⅰ型膠原酶2.0-3.0mL，37℃條件下間斷震蕩消化3h，PBS終止消化后，過篩，1000r/min離心5min后，棄上清，用細胞培養液(DMEM+體積分數10%血清+1%雙抗)重懸細胞，在37℃、體積分數為5%的CO2條件下培養三四天，細胞貼壁后換液，以后每兩三天換液1次，待細胞融合達到70%-80%時，傳代擴增。脂肪干細胞的分離、培養及鑒定：無菌條件下取本院整形外科20-30歲吸脂患者的皮下脂肪5-10mL，PBS徹底沖洗，剔除血管和筋膜后剪碎，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃水浴消化，20-30min后終止，過篩、離心后用人脂肪干細胞的專用培養液重懸細胞，接種于25mm2培養瓶中，培養條件同前。待細胞傳至第3代時，做流式鑒定(選取的表面標志為CD13，CD14，CD44，CD90，CD105，CD34)和多向誘導分化，成脂誘導14d后，油紅O染色；成骨誘導14d后，茜素紅染色；成神經元誘導7d后甲苯胺藍染色。脂肪干細胞條件培養液的制備及蛋白芯片分析：選擇生長良好的第3代脂肪干細胞，待細胞融合達80%時，換無血清的DMEM/F12培養基培養48h，收集上清，1000r/min離心5min，保留上清，0.22μm濾膜過濾，分裝，-80℃凍存備用。取5mL脂肪干細胞條件培養液，采用蛋白芯片法對其蛋白含量進行檢測分析，此法可針對507種細胞因子的含量進行定性及半定量檢測，檢測步驟及分析方法參考RayBioBiotinLabel-basedHumanAntibodyArrayI說明書(Cat#:AAH-BLM-1-2)。

脂肪干細胞條件培養液中血管內皮生長因子、血小板源性生長因子及堿性成纖維細胞生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響：選擇第3-5代口腔黏膜成纖維細胞，待細胞融合達到70%-80%時，胰酶消化1min，終止消化后將細胞制成濃度為5×107L-1的細胞懸液，種于96孔板中(100μL/孔)，約4h待細胞貼壁后換液，分別設陰性對照組(DMEM/F12)、空白對照組(脂肪干細胞條件培養液)、血管內皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子3種因子的濃度梯度實驗組(脂肪干細胞條件培養液+1，10，20，50，100μg/L質量濃度的因子)，以及分別加入各上述因子中和抗體的實驗組(脂肪干細胞條件培養液+中和抗體)，每組設5個復孔。采用CCK-8法，用酶標儀在光波波長為450nm的條件下，分別于1，2，3，4，5d檢測各組的吸光度值(A)，比較在對數生長期(第3天)時各濃度梯度下血管內皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子3種因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響。主要觀察指標：①脂肪干細胞條件培養液蛋白芯片分析結果。②脂肪干細胞條件培養液中血管內皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響。統計學分析：實驗數據均以x_±s表示，趙佳佳和胡麗應用SPSS16.0統計軟件對資料進行分析。多組間差異比較用方差分析，兩組間差異比較用t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性意義

2結果

2.1細胞培養結果

口腔黏膜成纖維細胞扁平，呈梭形，脂肪干細胞原代接種后，由短梭形和多角形逐漸變為長梭形流式檢測結果顯示人脂肪干細胞高表達CD13(99.49%)，CD44(92.13%)，CD90(97.78%)，CD105(96.82%)，而低表達CD14(1.14%)，CD34(2.71%)。脂肪干細胞成脂、成骨及成神經元細胞誘導及鑒定結果

2.2脂肪干細胞條件

培養液蛋白芯片分析結果檢測脂肪干細胞條件培養液中507種因子的信號平均值見表1，其中血管內皮生長因子(信號值SV=360.5)、血小板源性生長因子(信號值SV=363.5)以及堿性成纖維細胞生長因子(信號值SV=389.5)信號平均值均大于300，與陰性對照組比較差異有非常顯著性意義(P<0.001)。

2.3脂肪干細胞條件

培養液中血管內皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響結果顯示，脂肪干細胞條件培養液對口腔黏膜成纖維細胞增殖有明顯的促進作用，差異有顯著性意義(P≤0.05)進一步研究發現，在脂肪干細胞條件培養液中，血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖有明顯的促進作用，且隨著因子濃度的增高而呈現峰值性改變，其中堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在1μg/L時即達到了峰值，且在脂肪干細胞條件培養液中加入堿性成纖維細胞生長因子的中和抗體后，明顯抑制了脂肪干細胞條件培養液對成纖維細胞的增殖作用血小板源性生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在50μg/L時達到了峰值，且在脂肪干細胞條件培養液中加入血小板源性生長因子的中和抗體后，也可明顯抑制脂肪干細胞條件培養液對成纖維細胞的增殖作用，差異有顯著性意義(P≤0.05)；而血管內皮生長因子對成纖維細胞的增殖并沒有明顯的促進作用，且在脂肪干細胞條件培養液中加入血管內皮生長因子的中和抗體后，也沒有明顯抑制脂肪干細胞條件培養液對成纖維細胞的增殖作用

3討論

在正常的生理情況下，口腔黏膜相對于皮膚而言，具有創傷后愈合快，形成瘢痕組織少的特點。然而，在一些病理條件下，如復發性阿弗他口腔潰瘍，口腔黏膜大面積缺損等臨床病例中，由于全身因素及細胞所處的微環境等條件的改變，如嚴重的炎癥反應等，黏膜的愈合能力受到了限制，創面愈合延遲，且更易形成瘢痕組織。值得關注的是，脂肪干細胞除了具有易于分離、培養和擴增，免疫調節性，可以被反轉錄病毒高效轉染等其他成體干細胞所不能比擬的優越性能之外，脂肪干細胞有向炎癥和受損組織部位歸巢的特性，而其分泌的細胞因子也可以為受損組織提供營養支持。因此，實驗通過研究脂肪干細胞分泌的生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響，從一方面證實了其對口腔黏膜創傷修復的促進作用，為脂肪干細胞及其分泌的生長因子在口腔黏膜創傷修復中的臨床應用提供了理論依據。實驗結果顯示，脂肪干細胞條件培養液對口腔黏膜成纖維細胞遷移具有明顯的促進作用，為了探究脂肪干細胞條件培養液中促進創傷修復的因子種類，本實驗對脂肪干細胞條件培養液進行了蛋白芯片分析。結果發現，在表達量較高(>300倍)的57種相關活性因子中(數據未顯示)，有的因子對血管再生具有明顯的促進作用，如血管生成素1，4、內皮素、血小板反應蛋白以及白細胞介素22等；有的因子，包括血管內皮生長因子、血小板源性生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、巨噬細胞刺激蛋白等在內，對與創傷修復相關的效應細胞的遷移和增殖具有明顯的促進作用，利于血管形成以及上皮再生；除此之外，這次實驗發現脂肪干細胞條件培養液中還具有一些特殊效應的因子，如外異蛋白A2，該因子是腫瘤壞死因子家族的成員之一，與外胚層器官，尤其是皮膚附屬器，如毛囊、汗腺的發育密切相關。

上述結果證實，脂肪干細胞條件培養液中含有多種脂肪干細胞分泌的，與創傷修復相關的生物活性因子，各種因子共同作用，在創傷修復的各個階段，促進創傷的愈合。為了進一步探究脂肪干細胞條件培養液在創傷修復過程中對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響及作用機制，這次實驗選擇血管內皮生長因子、血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，這3種與細胞增殖及遷移密切相關且在脂肪干細胞條件培養液中高表達(>300倍)的細胞因子，分別檢測其對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響。結果發現，血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞的增殖有明顯的促進作用，且隨著因子濃度的增高而呈現峰值性改變，其中堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在1μg/L時即達到了峰值，血小板源性生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在50μg/L時達到了峰值，且分別在脂肪干細胞條件培養液中加入兩者的中和抗體圖8血小板源性生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的作用Figure8Effectofplatelet-derivedgrowthfactorontheproliferationoforalmucosafibroblasts1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10A空白對照組與空白對照組比較，aP<0.05。注：血小板源性生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在50μg/L時達到了峰值，且在脂肪干細胞條件培養液中加入血小板源性生長因子的中和抗體后，也可明顯抑制脂肪干細胞條件培養液對成纖維細胞的增殖作用。中和抗體組aaa1102050100堿性成纖維細胞生長因子(μg/L)圖9血管內皮生長因子因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的作用Figure9Effectofvascularendothelialgrowthfactorontheproliferationoforalmucosafibroblasts1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10A空白對照組注：血管內皮生長因子對成纖維細胞增殖沒有明顯的促進作用，且在脂肪干細胞條件培養液中加入血管內皮生長因子的中和抗體后，也沒有明顯抑制脂肪干細胞條件培養液對成纖維細胞的增殖作用。中和抗體組1102050100堿性成纖維細胞生長因子(μg/L)后，脂肪干細胞條件培養液對成纖維細胞增殖的作用得到了顯著的抑制，結果有顯著性差異(P≤0.05)。

同時，實驗發現，雖然血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞的增殖具有明顯促進作用，但是有各自的適宜濃度，高濃度的堿性成纖維細胞生長因子(≥20μg/L)和低濃度的血小板源性生長因子(≤20μg/L)對成纖維細胞增殖的促進作用并不是很明顯。上述結果提示，在脂肪干細胞條件培養液中，對成纖維細胞的增殖具有明顯促進作用的因子可能為血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，且這種作用對因子的濃度具有依賴性和適宜性。堿性成纖維細胞生長因子是一類研究比較成熟的生長因子，在體內外均可表現出廣泛的生物學活性。堿性成纖維細胞生長因子來源于成纖維細胞、血管內皮細胞、軟骨細胞等，其基本生物學作用是促進細胞分裂增殖,可增強有絲分裂活性。大量體外及體內研究證實，組織損傷后，局部堿性成纖維細胞生長因子表達增加，通過趨化作用使炎癥細胞，成纖維細胞等向損傷部位聚集，同時通過促進效應細胞增殖，遷移，促進血管及肉芽組織的形成，從而促進損傷修復與重建。除此之外，近年來，越來越多的文獻報道，在口腔中，堿性成纖維細胞生長因子對牙周膜組織中的成纖維細胞及牙髓細胞均具有促進其增殖和遷移的作用。

大量研究證實，血小板源性生長因子可由多種細胞，例如成纖維細胞、炎癥細胞等分泌合成，其在體內體外均具有豐富的生物學活性，與創傷修復過程有密切的聯系，其中，一個重要的機制即促進成纖維細胞的增殖和遷移。近年來，亦有研究證實，在口腔中血小板源性生長因子具有促進牙齦及牙周膜組織中成纖維細胞增殖和遷移的作用。上述實驗結果提示，在創傷修復的早期階段，可以通過調節脂肪干細胞條件培養液中因子種類，并適當選擇和提高脂肪干細胞條件培養液中血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等細胞因子的濃度，從而促進口腔黏膜成纖維細胞增殖，將利于脂肪干細胞條件培養液在創傷修復中的應用。血管內皮生長因子屬于血小板源性生長因子/血管內皮生長因子家族，主要作用于內皮細胞，相關研究證實，血管內皮生長因子具有提高血管滲透性，促進內皮細胞的生長和遷移，抑制細胞凋亡等生物學活性，從而可以促進血管的發生和生成，在創傷修復過程發揮重要的作用。然而，本文結果發現，血管內皮生長因子對成纖維細胞增殖并沒有顯著的促進作用，上述結果提示，黏膜成纖維細胞的增殖很可能并不是由血管內皮生長因子進行調節的。

4結論

綜上所述，在創傷修復過程中，脂肪干細胞條件培養液可以促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖，且脂肪干細胞條件培養液中的多種生物活性因子可以共同促進創傷修復，因此，相較于單一應用的商品化生產的細胞因子，脂肪干細胞條件培養液更具有其臨床應用前景。然而創傷修復是一個復雜的生物學過程，血管內皮生長因子、血管源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖的作用機制仍需要體內實驗的驗證；另外，脂肪干細胞條件培養液中其他因子對創傷修復的作用及其作用機制仍將是后續的研究方向。

作者：趙佳佳 胡麗 劉加榮 宮妮雅 陳莉莉 單位：華中科技大學